Mayo 2019
Se van a transformar bacterias de E. coli K-12, para ellos mediante un choque térmico se les va a introducir el plásmido pGLO.
Los estudiantes han realizan un sencillo procedimiento para transformar bacterias con un gen que codifica la síntesis de una proteína denominada GFP (Green Fluorescent Protein). La fuente natural de este gen es una medusa fosforescente llamada Aequorea victoria, en la que la GFP es la responsable de que la medusa brille o emita fluorescencia en laoscuridad. Después de la transformación, las bacterias expresan el gen de la medusa y sintetizan la proteína, lo que les permite emitir un color verde brillante cuando son expuestas a luz ultravioleta. que contiene, además de la proteína GFP, el gen para la producción de betalactamasas, lo que hace a la bacteria portadora de este gen ser resistente a la ampicilina. Las betalactamasas son enzimas producidas y excretadas por las bacterias que contienen estos plásmidos. Las betalactamasas inactivan la ampicilina presente en el agar LB, permitiendo el crecimiento bacteriano. Únicamente las bacterias transformadas con el plásmido y que expresan las betalactamasas sobrevivirán en las placas que contienen ampicilina. Sólo un reducido porcentaje de células captan el plásmido. Las células que no se transforman no pueden crecer en las placas con ampicilina.
La expresión génica está estrechamente regulada en todos los organismos para permitir la
adaptación a diferentes condiciones y para evitar una superproducción de proteínas innecesarias. Los
genes implicados en la degradación de los diferentes nutrientes son un buen ejemplo de genes con
una alta regulación. Por ejemplo, la arabinosa es una fuente de energía y de carbono para la bacteria.
Los genes bacterianos que codifican las enzimas para degradar la arabinosa no se expresan cuando
no hay arabinosa en el medio. Pero cuando hay arabinosa, los genes se activan, volviéndose a
inactivar cuando se agota la arabinosa.
La arabinosa inicia la transcripción de estos genes induciendo la unión de la ARN polimerasa. En el
plásmido modificado genéticamente pGLO, algunos de los genes implicados en la degradación de la
arabinosa han sido sustituidos por los genes que en la medusa codifican la proteína GFP. Cuando las
bacterias transformadas con el plásmido pGLO están creciendo en presencia de arabinosa, el gen GFP
se activa y las bacterias emiten un color verde brillante cuando se exponen a luz ultravioleta.
En ausencia de arabinosa en el medio, el gen GFP permanece inactivado y las colonias bacterianas
son de color blanco.
Primer día.
Se comienza aprendiendo a pipetear con las pipetas pasteur:
Se revisan los protocolos:
Todo desinfectado y preparado:
Para preparar el agar, añadir 500 ml de agua destilada a un matraz Erlenmeyer de 1 litro. Añadir el
contenido del paquete de agar LB. Agitar el matraz para disolver el agar, y calentar hasta ebullición en
el microondas. Volver a agitar y calentar unas tres veces más hasta que el agar se disuelva, teniendo
cuidado de dejar enfriar el matraz antes de agitarlo, para evitar que el medio caliente salte a la mano.
Mientras tanto se prepara la Arabinosa, con la solución de transformación y la ampicilina, antibiótico necesraio para controlar si se ha producido la transformación, al igual que la arabinosa es necesaria para que se pueda expresar el gen que se va a transformar.
La arabinosa se prepara con una pipeta estéril, añade 3 ml de la solución de transformación en el vial para rehidratar el azúcar.
añade 3 ml de la solución de transformación al vial para rehidratar el antibiótico (Se utiliza la solución de transformación porque está estéril)
Se preparan, para después echárselo al medio de cultivo:
Es hora de rotular las placas:
- LB Agar (-)
- LB Agar/ ampicilina (-)
- LB Agar/ ampicilina (+)
- LB Agar/ ampicilina/ arabinosa (+)
El agar está apunto:
ºC).
Se termina de rotular las placas:
Se comienza a preparar las placas con LB- Agar:
Posteriormente se aporta el antibiótico. Comenzamos a echar el LB Agar/ampicilina:
Y por último se aporta la arabinosa, para preparar las placas LB-Agar/Ampicilina/ Arabinosa:
Todas las placas preparadas:
Y se guardan en la estufa para que solidifique el medio de cultivo:
2º Día
Ya tenemos las placas petri preparadas para sembrar. De manera que lo que hay que hacer es rehidratar E. coli que se encuentra liofilizada:
Con una pipeta estéril, rehidratar el liofilizado de E. coli HB101 añadiendo 250 ml de la solución de
transformación en el vial. Tapar el vial y dejar la suspensión 5 minutos a temperatura ambiente. Agitar el vial antes de añadirlo a las placas de LB.
Preparados para la rehidratación:
Una vez rehidratada E. coli, se siembran las placas por cuadrantes:
Las placas sembradas se incuban a 37 ºC:
Y se guardan en el frigorífico:
3º Día
Empezamos ensayando para coger el plásmido:
Vemos que nos han crecido E. coli, que se caracteriza por presentar colonias de color crema, redondas y de bordes lisos.
Con una pipeta estéril añadir 250 ml de la solución de transformación en el vial que contiene el
plásmido pGLO liofilizado. La cantidad de ADN es tan pequeña que puede parecer que el vial está
vacío.
Todo listo para comenzar. Lo primero se añade 1 ml de la solución de transformación (CaCl2) y 1 ml del caldo LB en los tubos eppendorf de 2 ml.
Etiquetamos los tubos eppendorf:
(+): con plásmido
(-): sin plásmido
Comprobamos si presenta fluorescencia el plásmido...
Todos listo!!!
Se introduce E. coli, en los dos tubos eppendorf:
Choque térmico:
- Incubar los tubos en hielo 10 minutos.
al baño ya preparado a 42 ºC, e introducirlos
allí durante 50 segundos exactos.
Cuando se encuentra a la temperatura adecuada:
Se introduce durante 50 segundos:
Asegurándonos de que se encuentre los tubos en el agua caliente.
- Llevar de nuevo los tubos al hielo. El cambio de hielo al baño y
viceversa debe hacerse con rapidez. Dejar los tubos en el hielo 2 minutos.
Rotulamos las placas poniendo las (+) y (-)
Ya solo queda sembrar:
Todo listo!!! se meten en la estufa a 37º C y a esperar 24 horas:
Lo que nos debería salir:
Último día: Resultados
Realizado por Sara Alaminos y Jose Juaquín Bermo
Realizado por Jose Manuel y Crhistian
Realizado por Alba y Laura
Realizado por Cristina y Ana
